Aprovada pelo Papa Paulo III em 1540, a Companhia de Jesus era formada por poucos, mas ardorosos membros, preocupados em revigorar a fé católica. Os primeiros jesuítas chegaram ao Brasil em 1549, junto com Tomé de Sousa, liderados pelo Padre Manoel da Nóbrega. Eram pobres e pouco recebiam da Companhia para sobreviver. Comiam com os criados de governantes e contavam, mensalmente, com um cruzado em ferro para sua manutenção. Essa quantia era aplicada por eles no ensino dos meninos indígenas. Foi em São Vicente que o Padre Leonardo Nunes construiu, em 1549, a primeira escola-seminário para os meninos brancos e índios que, ampliada em 1553, tornou-se o 2.º Colégio dos Jesuítas do Brasil. Eles estavam sempre mais suscetíveis às doenças, pois eram mal-alimentados, mal-abrigados, viviam sem higiene e andavam pelo meio das matas e rios para ir de uma aldeia à outra. A situação era tão precária que, em 1552, o próprio Padre Manoel da Nóbrega ainda vestia a única roupa que havia trazido consigo três anos antes.

É certo que o trabalho missionário produziu bons frutos na Vila de São Vicente e também na Vila de São Paulo de Piratininga, principalmente porque os religiosos percorriam as aldeias distribuindo presentes, socorrendo enfermos e ensinando músicas e brincadeiras às crianças. Porém, a interferência dos missionários em relação ao trabalho escravo indígena começou a gerar problemas para os jesuítas. Isso porque, cada vez mais, os colonos tratavam os índios com exagerada brutalidade, contrariando a Bula do Papa Paulo III, segundo a qual era vontade do Espírito Santo que se reconhecesse os índios americanos como verdadeiros homens.

A situação se agravou quando os padres procuraram influir nas autoridades locais. Além disso, receberam grandes propriedades por meio de doações dos donatários e, desafiando os colonos, decidiram passar a administração das terras para os índios. Em certo tempo, oficiais da Câmara de Vereadores chegaram até a expulsar os missionários da Capitania. Nesse período, os índios também começaram a se rebelar contra o trabalho escravo e passaram a atacar as lavouras agrícolas espalhadas pela Vila de São Vicente. As tribos invadiam as terras, destruíam a plantação, quebravam as ferramentas e ameaçavam os colonos. E esse foi apenas um de muitos problemas que os agricultores tiveram que enfrentar aqui.